Wie man einen hängenden Tropfen Vorbereiten

Zur Bestimmung der 3D- Struktur eines Proteins , müssen Sie zunächst ein reiner Kristall davon. Die Hängetropfenverfahrenwird ein Tropfen der proteinhaltigen Lösung hängen von einer Deck . Unterhalb dieser hängenden Tropfen liegt ein Reservoir mit einer höheren Salzkonzentration als die der Tropfen. Im Laufe der Zeit Wasserdampf verläßt den Tropfen und endet in dem Behälter , wodurch das Protein zu kristallisieren. Jedes Protein verschiedenen Bedingungen ( wie Salzkonzentration und pH-Wert) , und oft Versuch und Irrtum bietet die einzige Möglichkeit , um die richtigen conditions.Things finden Sie brauchen
Laborkittel , Schutzhandschuhe und Schutzbrille
Mikropipette mit Pipette erfordert Tipps
1 molaren Lösung von Natriumchlorid in 0,05 M Acetat-Puffer , pH 4,7
2 ml Eppendorf-Röhrchen (oder ähnlich)
Zentrifuge
24 -Well-Platte
Vakuumfett in der Spritze
silikonisierten Deckglas
Druckluft
Pinzette
Ton (zB Knetmasse oder ähnliches)
50 mg /ml Lysozym in 0,05 M Acetat-Pufferlösung , pH 4,7
Weitere Anweisungen zeigen

1

Setzen Sie auf Laborausrüstung ( Mantel, Handschuhe und Schutzbrille ) .
2

Mit einer Mikropipette auf 1,1 ml einer Natriumchlorid ( Salz) und Acetat-Pufferlösung in hinzufügen ein Eppendorf-Röhrchen .
3

zentrifugieren Sie die geschlossenen Eppendorf-Röhrchen mit der Salzlösung im Inneren für etwa fünf Minuten bei 13.000 Umdrehungen pro Minute. Denken Sie daran, die Zentrifuge , indem ein anderes Eppendorf-Röhrchen mit 1,1 ml Wasser gegenüber und gegenüber der Salzlösung Rohr auszugleichen.
4

1 ml der Salzlösung zu einem gut in einer 24-Well- Platte .
5

Mit einer Fettspritze, um eine dünne Fettschicht um den Rand dieses gut zu platzieren. Achten Sie darauf , nicht zu wenig oder zu viel hinzuzufügen. Wenn Sie zu viel Fett hinzufügen, wird das Fett in den Brunnen laufen und möglicherweise ruinieren Ihr Experiment . Wenn Sie zu wenig verwenden, wird das auch nicht luftdicht sein und Ihr Experiment wird nicht funktionieren. Richten Sie für nur wenig Fett , die das Deckglas und Fett bilden eine luftdichte Abdichtung später .
6

Rollen Sie den Ton mit den Händen zu vier kleine Kugeln zu machen, und schieben Sie sie auf die vier Ecken des 24- Well-Platte. Sie handeln als Träger , um die Abdeckung der Platte zu gewährleisten nicht in Kontakt mit dem Deckglas kommen .
7

mit Druckluft , um Staub aus der Deckglas zu blasen. Halten Sie das Deckglas mit einem Paar von sauberen Pinzette.
8

saugen bis 4 Mikroliter der Lysozym-Lösung mit Mikropipette , und fügen Sie diese Lösung auf die Mitte des Deckglases . Ändern Pipettenspitzen, und fügen Sie 4 Mikroliter der Salzlösung . Sanft Pipette auf und ab, saugen in Fluid dann vertreiben sie , um die Salzlösung mit der Lysozym-Lösung mischen. Achten Sie darauf , die beiden ohne Dispergieren der Flüssigkeit auf der ganzen Deckglas mischen.
9

Drehen Sie das Deckglas schnell vorbei , so dass die Flüssigkeit nicht abrutschen und Pflanzen es direkt oben auf dem Brunnen. Achten Sie darauf, sanft auf die Taste drücken , damit es eine luftdichte Abdichtung mit dem Fett rund um die Kanten des gut bildet .
10

Schieben Sie den Deckel des 24 -Well-Platte auf den Ton -Kugeln , und lassen Sie die Platte an einem kühlen Ort .